A lactose, açúcar presente no leite e seus derivados, é hidrolisada pela ação da enzima B-galactosidase gerando moléculas menores, a glicose e a galactose. A intolerância à lactose está associada à deficiência na produção da enzima lactase, sendo uma alternativa às pessoas com esta deficiência a ingestão de suplementos de lactase. A enzima B-galactosidase é importada, o que dificulta o seu acesso. O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição do meio de cultura para a produção da enzima B-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CBS 6556, a partir de fontes alternativas de carbono e nitrogênio. A partir de resultados preliminares de um delineamento experimental (25^-1), tendo como parâmetros variáveis soro de queijo, agitação, milhocina, temperatura e Prodex-lac, foi possível determinar as variáveis significativas na produção da enzima. A fim de otimizar a produção da enzima, foi realizado um planejamento experimental (DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional) tendo como variáveis soro de queijo (100 a 1000 mL.L^-1), milhocina (0 a 18 g.L^-1) e temperatura (25 a 45 ºC). Antes do ensaio, o soro de queijo sofreu processo de desproteinização, a fim de precipitar a parte protéica, pois sem esse processo prejudica as leituras de absorbância das amostras. Os experimentos foram conduzidos em frascos de Erlenmeyer de 1000 mL contendo 300 mL de meio de cultivo, por 24h com agitação de 220 min^-1, em shaker. Observando os valores de atividade enzimática, assim como os parâmetros significativos apontados no tratamento dos dados, conclui-se que o experimento contendo soro de queijo (820 mL.L^-1) e milhocina (14,36 g.L^-1) conduzidos a 31°C, foi o mais indicado para a produção de B-galactosidase atingindo uma atividade enzimática de 9,8 U.mL-1. Através da metodologia de superfícies de resposta o modelo para produção da enzima foi estabelecido e validado em triplicata sob as condições de (1000 mL.L^-1) e milhocina (18 g.L^-1) e 31°C, porém com atividade enzimática 9,1% menor do que o previsto. Nos ensaios seguintes, foi avaliada a influência da agitação e da aeração na produção da enzima por cultivo submerso em fermentador Biostat B de 2 L, onde as condições estudadas foram 200 min-1 e 1,33 vvm (KLa = 19 h^-1), e 400 min-1 e 2,67 vvm (KLa = 53 h^-1). Neste estudo verificou-se que a agitação e a aeração, exerceram influência na produção da enzima, sendo que na condição mais favorável, KLa = 53 h^-1 a atividade enzimática foi de 6,59 ± 0,20 U ml^-1.