em quantidades diminutas. Foi planejado de forma que numa única reação seja possível a detecção simultânea dos microrganismos investigados (Multiplex PCR). Neste sentido, dez seqüências codificantes para a fração 23S (bactérias) ou 18S (Candida) do RNA ribossomal foram obtidas do GenBank, sendo a seguir transformadas em seqüências consensos utilizando-se o programa BioEdit. Em conjunto, estas seqüências foram submetidas a programas (MuPlex, FastPCR, Vector NTI, Visual OMP) especializados na simulação de primers (iniciadores) para PCR. Os primeiros três programas foram descartados em razão de não garantirem a necessária exclusividade de reconhecimento em reações conjuntas. O programa Visual OMP mostrou-se satisfatório quanto à elevada especificidade de reconhecimento requerida. Os primers sugeridos pela simulação foram checados através da ferramenta computacional BLAST, comparando-os com a coleção de seqüências nucleotídicas depositadas no GenBank, correspondentes a inúmeros organismos distintos. Cada par de primers vem sendo testado em termociclador XP Cycler, sob diferentes condições de amplificação, variando-se a concentração de insumos, temperatura de pareamento e tempo de extensão. Os amplicons são resolvidos via eletroforese em gel de agarose, seguido de exposição à ultravioleta. A identificação do(s) agente(s) é realizada correlacionando-se com o tamanho planejado de amplicon de cada microrganismo avaliado, obtido com o emprego de cepas padrão. Paralelamente à padronização da metodologia molecular, o DNA total presente em amostras de sangue de pacientes com diagnóstico clínico de sepse (n=90) foi extraído e purificado (“Qiamp DNA Mini Kit”; Qiagen). As mesmas amostras também foram analisadas via hemocultura convencional, para fins de comparação entre os métodos. Atualmente, as condições ótimas para detecção de E.coli, P.aeruginosa, S.aureus e Candida spp. via PCR encontram-se definidas.