A lactose, açúcar presente no leite e seus derivados, é hidrolisada pela ação da enzima ²-galactosidase gerando moléculas menores, a glicose e a galactose. A intolerância à lactose esta associada à deficiência na produção da enzima lactase, sendo que, uma alternativa às pessoas com esta deficiência é a ingestão de suplementos de lactase. A enzima ²-galactosidase utilizada na fabricação destes suplementos é importada, fator que eleva o custo destes produtos, dificultando assim o seu acesso. O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição do meio de cultura para a produção da enzima ²-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CBS 6556, a partir de fontes alternativas de carbono e nitrogênio. A partir de resultados preliminares de um delineamento experimental (25-1), tendo como parâmetros variáveis soro de queijo, agitação, milhocina, temperatura e Prodex-lac, foi possível determinar as variáveis significativas na produção da enzima. As variáveis, agitação e Prodex-lac, não apresentaram efeito estatístico significativo na atividade enzimática dentro das faixas estudadas. A fim de otimizar a produção da enzima, foi realizado um novo planejamento experimental (DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional) tendo como variáveis soro de queijo (100 a 1000 mL.L-1), milhocina (0 a 18 g.L-1) e temperatura (25 a 45 ºC). Antes do ensaio, o soro de queijo sofreu processo de desproteinização, a fim de precipitar a parte protéica, pois sem esse processo prejudica as leituras de absorbância das amostras. Os experimentos foram conduzidos em frascos de Erlenmeyer de 1000 mL contendo 300 mL de meio de cultivo, por 24h com agitação de 220 min-1, em shaker. Os resultados apontaram que a temperatura de 31ºC foi favorável ao crescimento celular, principalmente em conjunto com uma concentração soro de queijo de 820 mL.L-1. Após o resultado das análises de produção de enzima ²-galactosidase, será possível determinar a melhor condição através dos valores de atividade enzimática e fatores de conversão substrato em produto. Após a avaliação, será realizada a validação do delineamento DCCR em triplicata e o início de experimentos em bioreator.