O biodiesel é fabricado a partir de fontes renováveis (girassol, soja, mamona), sendo um combustível que emite menos poluentes que o diesel. Por meio da Lei nº 11.097, de 13 de janeiro de 2005, foi estabelecida a obrigatoriedade da adição de um percentual mínimo de biodiesel ao óleo diesel comercializado ao consumidor, em qualquer parte do território nacional. O aumento da produção de biodiesel aumenta também a disponibilidade do seu principal subproduto, o glicerol, sendo necessário buscar alternativas para sua destinação. Neste trabalho cultivou-se a bactéria Cupriavidus necator DSM 545 em meio mineral, em fermentador de 2 L, contendo 1,5 L de meio, sendo que os ensaios foram conduzidos em duas condições: com e sem glicerol, utilizando glicerol purificado e ainda glicerol bruto proveniente da transesterificação de biodiesel proveniente de síntese por rota etílica e metílica, como fonte de carbono adicional na produção de P(3HB). As concentrações de açúcar invertido (30 g.L^-1) e glicerol (15 g.L^-1) e a temperatura de cultivo (38ºC) foram definidos conforme a melhor condição validada em experimento em shaker, avaliadas por meio de um delineamento composto central rotacional (DCCR) 2³ completo com 3 pontos centrais. As amostras foram analisadas quanto ao crescimento celular, produção de P(3HB) e consumo de glicerol e açúcar invertido. Os resultados revelaram que a produção e o acúmulo de P(3HB) no interior da célula foram muito similares, 7,0 g.L^-1 e 53,5 % para condição sem glicerol e 7,3 g.L^-1 e 53,0 % para ensaio com glicerol purificado, valores de produção 34 e 30 % superiores aos obtidos em shaker para as mesmas condições. Quando glicerol bruto proveniente da manufatura de biodiesel foi utilizado como co-substrato, foram obtidos concentrações de apenas 0,4 g.L^-1 de produção de P(3HB) para os dois ensaios.