Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica relacionada a um processo infeccioso. A elevada mortalidade e custos em ambientes hospitalares associam-se ao diagnóstico tardio do agente etiológico e à terapia imprecisa à base de antibióticos. Bacilos Gram negativos são os mais frequentes causadores de sepse, destacando-se Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae com crescente incidência e multirresistência. A investigação de micro-organismos através da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) tem sido expandida por intermédio dos sistemas de detecção múltipla, Multiplex-PCR, nos quais são empregados dois ou mais pares de iniciadores em uma única reação, possibilitando resultados rápidos e precisos e uma terapêutica com maiores chances de sucesso. Objetivo: Padronizar PCR para identificação de A. baumannii e K. pneumoniae, associados à ocorrência de sepse, com vistas à investigação destes a partir de amostras clínicas. Métodos: O DNA genômico das cepas padrão (A. baumanii ATCC 19606 e K. pneumoniae ATCC 13883) e das amostras clínicas advindas do Centro Hospitalar Unimed, em Joinville-SC, foram extraídos e purificados com o kit “Qiamp DNA Mini Kit” (Qiagen). Para avaliar a qualidade dos DNAs microbianos obtidos foram realizadas espectrofotometria, eletroforese em gel 1% agarose e amplificação com iniciadores bacterianos universais direcionados ao gene codificante para a fração 16S rRNA. A detecção específica foi avaliada utilizando-se iniciadores seletivos aos microrganismos de interesse e variando-se os parâmetros de termociclagem, incluindo quantidades de magnésio e iniciadores. O limite de sensibilidade do sistema foi analisado via diluição seriada (500 ng/¼L a 50 fg/¼L) de cada DNA microbiano alvo e a especificidade foi testada empregando-se um painel de DNAs microbianos e humano não correspondentes aos iniciadores utilizados na PCR. Adicionalmente, procedeu-se a avaliação da Multiplex-PCR empregando-se as condições estabelecidas para a amplificação isolada dos patógenos. Resultados: Obtiveram-se amplificações em condições únicas de reação e termociclagem para os micro-organismos A. baumannii (722 pb) e K. pneumoniae (374 pb), utilizando-se cepas padrão. O sistema demonstrou ser especifico aos micro-organismos alvos. A quantidade de 1 ng de DNA microbiano correspondeu ao limite de sensibilidade do sistema. Conclusão: Através da otimização da reação, observou-se a possibilidade da detecção conjunta (Multiplex-PCR) de A. baumannii e K. pneumoniae, em tempo inferior aos métodos de diagnóstico convencionais, permitindo antecipação da identificação microbiana, o que, em consequência, favoreceria uma melhor conduta terapêutica. Contudo, não foi obtida a identificação dos patógenos em amostras de sangue, não sendo possível confirmar sua aplicabilidade até o momento.