Introdução: Sabe-se que o acumulo de espécies reativas de oxigênio, como radical superóxido e o peróxido de hidrogênio, pode estar relacionado às complicações da galactosemia, como por exemplo, as complicações neurológicas, devido à autoxidação. Neste trabalho avaliou-se os efeitos in vitro da galactose sobre a atividade da enzima Na+K+-ATPase em córtex cerebral, hipocampo e cerebelo de ratos, além da influência dos antioxidantes trolox (±-tocoferol), ácido ascórbico e glutationa sobre os efeitos in vitro da galactose sobre esta enzima. Materiais e métodos: Para os experimentos in vitro, o córtex cerebral, cerebelo e hipocampo foram incubados por 1 h a 37ºC com galactose nas concentrações de 0,1, 3,0, 5,0 e 10,0 mM. O grupo controle foi incubado sem a adição de galactose. Após, foi determinada a atividade da Na+K+-ATPase pelo método descrito por Wyse et al., (2000). Resultados e discussão: Os resultados mostraram que a galactose na concentração de 10,0 mM diminuiu a atividade da Na+K+-ATPase em córtex cerebral (p<0,05, n=7) e hipocampo (p<0,01, n=7). Por outro lado, a galactose nas concentrações de 3,0 e 5,0 mM aumentou a atividade da Na+K+-ATPase em cerebelo (p<0,001, n=7) de ratos. Quanto às substâncias antioxidantes, a glutationa preveniu a alteração na atividade da enzima causada pela galactose em cerebelo e preveniu parcialmente em córtex cerebral e hipocampo. Já o trolox preveniu a alteração em hipocampo, mas não em córtex cerebral e cerebelo, onde aumentou a atividade da enzima. Com relação ao ácido ascórbico, se observou diminuição da atividade da Na+K+-ATPase em todas as estruturas cerebrais e não houve prevenção das alterações. Conclusão: Nossos resultados demonstram que a atividade da enzima Na+K+-ATPase está alterada na galactosemia clássica, possivelmente relacionada ao acúmulo de radicais livres e aumento do estresse oxidativo, tendo em vista que essas alterações foram revertidas pelas substâncias antioxidantes glutationa e trolox. Por outro lado, os antioxidantes ácido ascórbico e o trolox, em córtex cerebral e cerebelo, alteraram a atividade da enzima e não foram capazes de prevenir as alterações causadas pela galactose.