Fungos do gênero Pleurotus são reconhecidos mundialmente por suas diversas ações medicinais. Mais especificamente, polissacarídeos do tipo β-glicanos produzidos por fungos do gênero Pleurotus são os responsáveis pela estimulação do sistema imune de diversos organismos, conferindo-lhes ação antitumoral. Em 2005, de um total de 58 milhões de mortes registradas no mundo, o câncer foi responsável por 7,6 milhões, o que representou 13% de todas as mortes. No Brasil, as estimativas para o ano de 2008, válidas também para o ano de 2009, apontam que ocorrerão 466.730 novos casos de câncer. Polissacarídeos do tipo β-glicanos podem ser obtidos tanto do corpo frutífero quanto da biomassa e do meio de cultivo de fungos do gênero Pleurotus. Utilizando-se o meio de cultivo para obtenção destes polissacarídeos algumas vantagens são observadas como: maior controle das condições de cultivo, menor esforço e espaço para o cultivo, menor chance de contaminação, bem como menor custo para recuperação dos polissacarídeos. Contudo, alguns fatores como composição do meio de cultivo, valor do pH inicial e temperatura de cultivo, bem como fluxo de aeração, velocidade de agitação, etc., devem ser observados a fim de se maximizar a produção destes polissacarídeos. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da formulação do meio de cultivo sobre a concentração de polissacarídeos extracelulares no cultivo de Pleurotus sajor-caju, em frascos agitados. Para tanto, foi utilizado um planejamento fatorial (22), avaliando-se a influência da concentração inicial de sulfato de amônio, nos níveis 2,5 e 5,0 g/L e de extrato de levedura, nos níveis 1,0 e 2,0 g/L. A maior concentração (0,6 g/L) de polissacarídeos extracelulares foi obtida quando se utilizou as menores concentrações das duas fontes de nitrogênio: sulfato de amônio (2,5 g/L) e extrato de levedura (1 g/L).